ما هو تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)؟ حقائق عن الاختبار ، والخطوات المستخدمة ل

ما هو PCR (تفاعل البلمرة المتسلسل)؟

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) عبارة عن تقنية تستخدم لتضخيم كميات ضئيلة من الحمض النووي (وفي بعض الحالات ، RNA) الموجودة في أو على أي سائل أو سطح تقريبًا حيث يمكن إيداع شرائط DNA. إن مفتاح فهم PCR هو معرفة أن كل إنسان أو حيوان أو نبات أو طفيل أو بكتيريا أو فيروس يحتوي على مواد وراثية مثل تسلسل الحمض النووي (RNA) (متواليات النيوكليوتيدات أو أجزاء من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي) التي تنفرد بأنواعها ، وإلى الفرد الفرد من هذا النوع. وبالتالي ، إذا كانت العينة تحتوي على أجزاء من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ، فإن PCR هي طريقة تستخدم لتضخيم (عمل نسخ أكثر متطابقة) من هذه التسلسلات الفريدة بحيث يمكن استخدامها لتحديد احتمال المصدر بدرجة عالية جدًا (أ) شخص محدد أو حيوان أو كائن ممرض) من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي الموجود في أو على أي عينة تقريبًا من المواد.

PCR التضخيم هو جزء فقط من اختبار تحديد ، ولكن. بمجرد الانتهاء من التضخيم (انظر أدناه) ، يجب مقارنة الأجزاء المكبرة بقطاعات النوكليوتيدات الأخرى من مصدر معروف (على سبيل المثال ، شخص معين أو حيوان أو كائن مُمرض). غالبًا ما يتم إجراء هذه المقارنة بين القطاعات الفريدة من خلال وضع تسلسلات النوكليوتيدات الناتجة عن PCR بجوار تسلسلات النوكليوتيدات المعروفة من البشر أو مسببات الأمراض أو مصادر أخرى في هلام منفصل. يتم تشغيل التيار الكهربائي عبر الهلام وتشكل سلاسل النيوكليوتيدات المختلفة نطاقات تشبه "السلم" وفقًا لشحنتها الكهربائية وحجمها الجزيئي. وهذا ما يسمى هلام الكهربائي. الأشرطة أو "السلم" مثل الخطوات التي تهاجر إلى نفس المستويات في الجل تظهر هوية متواليات النيوكليوتيدات. هذه الطريقة هي واحدة من أكثر الطرق شيوعًا لاستكمال اختبارات PCR (انظر الشكل 1).

الشكل 1 ، العصابات أو "سلم" مثل خطوات PCR أنتجت الحمض النووي من المتفطرة (مجاملة من CDC)

الشكل. تقوم العناصر المتكررة (Rep) –PCR (A) ونمذجة هلام الحقل الكهربائي النبضي (PFGE) (B) لنماذج المتفطرة التجميلية بمعزل عن مريضين في أوهايو ومريض واحد في فنزويلا. تم تنفيذ Rep-PCR باستخدام BOXA1R primer (3) ، وتم تنفيذ PFGE مع تقييد إنزيم AseI. الممرات 1 ، 2 ، أوهايو تعزل OH1 و OH2 ؛ الممرات 3 ، 4 ، سلالات التحكم ATCC BAA-878T و ATCC BAA-879 ؛ حارة 5 ، عزل الفنزويلي VZ1. معايير حجم الحمض النووي هي 100 نقطة أساس (S1) و 48.5 كيلو بايت علامة (S2).

كيف يتم تفاعل PCR (تفاعل البلمرة المتسلسل)؟

في عام 1983 ، اكتشف كاري موليس الخطوات الأساسية لتضخيم تسلسل الحمض النووي. حصل هو ومايكل سميث على جائزة نوبل لتطوير هذا الإجراء في عام 1993. هناك بضع خطوات أساسية متبعة بالتسلسل ؛ يمكن أن يتم PCR في أنبوب واحد مع المواد الكيميائية المناسبة وسخان المصممة خصيصا. الكواشف أو المواد الكيميائية اللازمة هي كما يلي:

• عينة تحتوي على تسلسل النيوكليوتيدات (من الدم والشعر والقيح وقشط الجلد ، إلخ)
• بادئات الحمض النووي (DNA): الحمض النووي قصير المفرد الذي يرتبط بسلسلة النيوكليوتيدات التي تعزز توليف حبلا مكملاً للنيوكليوتيدات
• بوليميريز الحمض النووي (DNA polymerase): إنزيم ، عندما يكون للحمض النووي رابطًا أوليًا ، ينزل جزء الحمض النووي الذي يربط لبنات بناء الحمض النووي لتشكيل أزواج قاعدة مكملة وبالتالي يقوم بتركيب حبلا نيوكليوتيدات مكمل للحمض النووي (إدخال بوليميريز الحمض النووي المقاوم للحرارة ، Taq البلمرة ، المستمدة من البكتيريا المقاومة للحرارة ، تحسنت بشكل ملحوظ القدرة على أداء PCR)
• يوجد فائض كبير من كتل بناء الحمض النووي التي تسمى النيوكليوتيدات (الأدينين ، الثيميدين ، السيتوزين ، الجوانيين ، والمختصرة كـ: A ، T ، C ، و G ، على التوالي) في المحلول. عندما يتم ربط هذه الكتل معًا ، فإنها تشكل تسلسلًا من النيوكليوتيدات أو سلسلة واحدة من الحمض النووي. عندما تربط هذه اللبنات الأساسية لبناتها التكميلية عن طريق روابط هيدروجينية ضعيفة (على سبيل المثال ، لن ترتبط إلا مع T و G فقط مع C) ، يتشكل تسلسل نووي النيكلوتيدات التكميلي ويرتبط بالحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل. عند اكتمال الربط ، يتم تشكيل الحمض النووي المزدوج التكميلي في تسلسل معين.

PCR ، إذن ، يبدأ بجزء من الحمض النووي من عينة يتم وضعها في أنبوب مع الكواشف المذكورة أعلاه. يتم تسخين المحلول إلى 94 درجة مئوية على الأقل (201.2 فهرنهايت) ؛ تعمل هذه الحرارة على كسر الروابط الهيدروجينية التي تسمح لشرائح الحمض النووي التكميلي بالتشكيل ، لذلك لا توجد إلا سلاسل مفردة في المزيج (يُطلق على هذا اسم تغيير الحمض النووي المزدوج).

يُسمح للخليط بالتبريد إلى حوالي 54 درجة مئوية (129.2 فهرنهايت). عند درجة الحرارة هذه ، ترتبط بادئات الحمض النووي وبوليمرات الحمض النووي بالحمض النووي المنفرد المفرد الذين تقطعت بهم السبل (وهذا ما يسمى الصلب لل DNA). نظرًا لوجود كتل بناء زائدة (تركيز عالٍ) في الخليط ، فإن البوليميراز يستخدمها في عمل خيوط تكميلية جديدة من الحمض النووي (تسمى امتداد الحمض النووي) وهذه العملية أكثر سرعة عند 72 مئوية (161.6 فهرنهايت). تخلق هذه العملية جزيء DNA مزدوج الجديلة من كل فرع من فروع الجزيء الأصلي.

تتكرر هذه الدورة حوالي 40 مرة في آلة تسمى دورة حرارية تقوم تلقائيًا بتكرار دورات تبريد التدفئة ، حيث تتضاعف كمية كل تسلسل من الحمض النووي في كل مرة يتم فيها إكمال دورة تبريد التدفئة. ما كان في البداية شريحة قصيرة من الحمض النووي يمكن تضخيمها إلى حوالي 100 مليار نسخة بعد 40 دورة مضاعفة.

لماذا يطلب الطبيب اختبار PCR (تفاعل البلمرة المتسلسل)؟

يشكل اختبار PCR الأساس لعدد من الاختبارات التي يمكن أن تجيب على العديد من الأسئلة الطبية المختلفة التي تساعد الأطباء على تشخيص وعلاج المرضى. على سبيل المثال ، يمكن لاختبارات PCR اكتشاف الكائنات الحية المسببة للأمراض وتحديدها في المرضى ، خاصة تلك التي يصعب زراعتها (على سبيل المثال فيروس نقص المناعة البشرية وغيره من الفيروسات وبعض الفطريات).

يطلب الأطباء الآخرون اختبارات PCR للمساعدة في تشخيص الأمراض الوراثية ، بينما يستخدم الأطباء الآخرون PCR للكشف عن العلاقات البيولوجية مثل تحديد آباء الأطفال. تُستخدم اختبارات PCR أيضًا لتحديد وتوصيف الطفرات الوراثية وإعادة الترتيب الموجودة في بعض أنواع السرطان.

ومع ذلك ، فقد تم تعديل اختبارات PCR وتوسعت في العديد من جوانب التحقيقات العلمية بما في ذلك البيولوجيا التطورية ، وبصمات الأصابع الجينية ، وتحقيقات الطب الشرعي ، وغيرها الكثير.

ما هو RT-PCR؟

RT-PCR هو اختبار PCR الذي تم تصميمه لكشف وقياس الحمض النووي الريبي. على الرغم من أن اختبارات PCR الأولية تضخيم الحمض النووي ، فإن العديد من الفيروسات والمكونات البيولوجية الأخرى (على سبيل المثال ، الميتوكوندريا) تستخدم الحمض النووي الريبي كمادة وراثية. يختلف RT-PCR عن PCR التقليدي عن طريق أخذ الحمض النووي الريبي أولاً وتحويل حبلا الحمض النووي الريبي إلى شريط DNA. يتم ذلك عن طريق نفس الطريقة في PCR الموضحة أعلاه باستثناء استخدام إنزيم يسمى transcriptase العكسي بدلاً من polymerase DNA. يسمح النسخ العكسي بترجمة جزء واحد من الحمض النووي الريبي إلى شريط مكمل من الحمض النووي. بمجرد حدوث هذا التفاعل ، يمكن عندئذٍ استخدام طريقة PCR الروتينية لتضخيم الحمض النووي. تم استخدام RT-PCR لاكتشاف ودراسة العديد من فيروسات RNA.

يجب عدم الخلط بين RT-PCR مع اختلاف آخر من PCR ، يُسمى Real-Time PCR. في الوقت الحقيقي PCR هو اختلاف PCR الذي يسمح بتحليل الحمض النووي تضخيم خلال الدورات المعتادة 40 من الإجراء. على الرغم من أن الإجراء يشبه PCR التقليدي مع ركوب الدراجات ، يستخدم Real-Time PCR أصباغ الفلورسنت المرتبطة ببعض الكتل اللبنية أو فروع النوكليوتيدات الصغيرة. اعتمادًا على الطريقة المستخدمة ، يحدث التألق عندما يتم تشكيل مسارات الحمض النووي المتضخمة. يمكن قياس مقدار التألق خلال الدورات الأربعين ويسمح للمحققين بقياس منتجات محددة وكمياتها خلال دورات التضخيم. غالبًا ما يسمح ذلك للمحققين أو فنيي المعمل بتخطي عملية الرحلان الكهربائي الهلامي أو غيرها من الإجراءات الثانوية اللازمة لتحليل منتجات PCR ، وبالتالي تحقيق نتائج أسرع.

في الوقت الحقيقي PCR و RT-PCR هي الاختلافات أو التعديلات لاختبار PCR الأصلي. ومع ذلك ، هناك العديد من الاختلافات (25 على الأقل) الموجودة وتستخدم لحل مشاكل محددة. لديهم جميعا أسماء مختلفة مثل التجميع PCR ، PCR التشغيل السريع ، Multiplex PCR ، PCR الصلبة المرحلة وغيرها الكثير.

من المحتمل أن يستمر تعديل PCR للمساعدة في الإجابة على أي أسئلة أخرى في الطب وعلم الأحياء. وغيرها من مجالات الدراسة.